第五期

执行主编：孔大陆教授

根据样本类型，单细胞测序技术可分为单细胞基因组（DNA）测序和单细胞转录组（RNA）测序。对于单细胞捕获和文库构建，目前已经开发了不同的方法，每种方法都有自己的技术特点。

(资料图片)

表1 单细胞测序常见技术类型和优缺点

（一）单细胞全基因组建库测序

由于人类单个二倍体细胞中能分离出的DNA含量极少，因此需要进行全基因组扩增（Whole Genome Amplification，WGA），以满足高通量测序的样本量需求。在单细胞全基因组建库及测序中，WGA是其关键步骤。

（二）单细胞全转录组建库及测序

单个细胞被捕获和裂解，释放的mRNA被反转录成cDNA，并通过Oligo-dT启动方法扩增以构建测序文库。双链cDNA合成可直接通过PCR实现，但可能引入扩增偏差。

单细胞全转录组测序可进行3’/5’端和全长测序，应根据研究目的选择合适的测序平台。一般来说，每个细胞读取50,000次就足以进行无偏差细胞聚类和标记识别。

单细胞测序在结直肠癌中的应用

（一）结直肠癌分型

单细胞测序技术是一种通过鉴定单个肿瘤细胞中的基因组改变和特有转录组水平来研究ITH的有效手段。因此单细胞测序技术可以为结直肠癌的分子分型提供了新的思路。

尽管通过单细胞RNA测序和批量分析鉴定的差异表达基因显著一致，但在批量分析中，大多数差异表达基因未被检测到。通过对肿瘤单细胞转录本进行研究，可以进一步完善现有的结直肠癌分类系统，有助于提出新的结直肠癌分子分型模型。

（二）异质性研究

肿瘤异质性是癌症诊断和治疗的关键问题。由于肿瘤组织是不同细胞的混合物，因此通常难以对癌症患者的肿瘤组织进行传统分析。单细胞测序使基因表达谱在细胞水平上得以实现。在此过程中，产生了新的细胞亚群具有EMT特性。同时研究还发现，在表达模式与小鼠细胞亚群相似的人类患者中，结直肠癌有显著的转移趋势。单细胞测序技术是研究结直肠癌异质性的重要手段，能够为结直肠癌的防治提供新的思路。

（三）结直肠癌转移中的研究

结直肠癌的高转移率（30%~50%）是导致患者死亡的重要原因。但是，目前已批准用于治疗转移性结直肠癌的靶向治疗方法不多，且已知的靶向药物对于BRAF和PIK3CA等基因的突变疗效甚微。如何选择转移性结直肠癌复杂特性的研究技术将成为开发新的诊断标志物和药物治疗靶点的关键。

与转录组测序相比，单细胞转录组能够根据细胞类型提供特异的诊断和预后标志物以及个体化癌症药物的治疗靶点，但是其在每个遗传谱系中的多层分子特征方面受到限制。因此，利用单细胞测序技术鉴定结直肠癌转移过程中关键的分子特征具有重要的研究价值。

（四）结直肠癌化疗耐药性机制探索

化疗耐药性是影响结直肠癌患者预后的重要因素。在晚期结直肠癌患者中，化疗是主要治疗方法，而耐药性的出现使得常规的化疗药物无法达到预期的疗效，因此探索化疗耐药性的机制是减少耐药性的产生、提高治疗效果、进而延长患者生存的关键。

研究表明，肿瘤细胞的转移和化疗耐药性关系紧密，因此，如果尽早发现化疗耐药性亚型以进行最佳或更积极的治疗，则可以避免肿瘤转移。然而，目前尚不清楚导致结直肠癌化疗耐药性的机制，而且当前的化疗不具有完全根除实体瘤的能力，易导致继发性肿瘤和复发。因此，根据基因表达、表观遗传学、通路特征和治疗反应来研究化疗耐药性癌细胞已成为当前的研究热点。

（五）肿瘤微环境

肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）由多种细胞类型组成，包括免疫细胞、炎性细胞、脂肪细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞，以及肿瘤内部和周围的非细胞成分。

在过去的十年中，免疫疗法已成为晚期结直肠癌患者潜在的有效全身疗法。肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）受到了极大的关注，因为它们可以直接影响预后和对免疫治疗的反应。在原发性人类肿瘤中基于单细胞测序的转录组分析不仅揭示了T细胞异质性，而且通过整合转录组和T细胞受体的分析也开始阐明T细胞群之间的动态关系。

未来，单细胞测序技术将在探索免疫细胞多样性、研究免疫治疗机制中发挥重要作用，为结直肠癌临床发展中的免疫治疗提供机制上的新见解。

单细胞测序技术，从细胞水平上探索结直肠癌的发生发展机制，将成为未来研究的热点。在基础研究方面，单细胞测序技术能够绘制结直肠癌发生发展过程中不同类型细胞的突变、表达、表观水平的变化，从而能够进一步阐明结直肠癌形成的分子机制。在临床研究方面，运用单细胞测序技术筛选和验证大量ITH及其相关的变异，既可以发现新的靶向药物，又可以开发出针对个体化药物敏感性导向治疗的预测性生物标志物，为开发精确和个性化的癌症治疗提供关键信息。

孔大陆教授评语：

先进和合理的检测手段是肿瘤精准诊疗体系中的重要环节。肿瘤内异质性是（ITH）在恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用，治疗过程中产生耐药性很大程度上可归因于ITH，所以准确地捕获ITH信息对于优化精准治疗策略尤其重要。作者认为单细胞测序技术抗疫在单细胞水平研究肿瘤组织地ITH，在本文中对单细胞测序的技术方法进行了介绍，就其在结直肠癌的分型、异质性、转移、耐药机制、肿瘤微环境等方面的研究加以阐述，并展望在临床研究领域的应用前景。